1796年，洪堡母親去世，他繼承了一筆小小的遺產，足以應付生活所需。于是他在次年便辭去政府官職，毅然決定離開舒適的生活環(huán)境，籌劃去美洲進行長途科學考察旅行。雖然美洲早在200年前就被哥倫布所發(fā)現，但它的自然面貌對歐洲科學家來說仍然是陌生的。
洪堡初次來到這新發(fā)現的南美洲大陸，大自然的一切他都感到很好奇。高山大川都留下了他攀登的足跡，奇花異草也采集了許多；從野獸隱沒的原始密林，人跡罕見的熱帶草原，到藏匿于河床下、洞穴里的未開化的原始部落，他都進行了造訪；從一只小小的飛蟲，到巨大巖洞中那些滅了種的部族人的尸骨，他都收藏起來。他用探索的眼光來看這奇異世界，同時用科學的頭腦思索著這一切的根源。1800年，他與邦普朗坐小船和獨木舟，沿著委內瑞拉最大的河流奧里諾科河劃行了.. 2760千米，對大部分無人居住的森林區(qū)進行了測量制圖，證實該河通過一條支流與南美第一大河亞馬遜河相通。途中遇到的艱辛是難以言喻的，他們不得不以香蕉和魚為主食，而且還經常遭到成群蚊蟲、螞蟻和其他昆蟲的叮咬，以及毒蛇、食人魚和鱷魚的侵襲。幾乎每個人都患了熱病，然而洪堡似乎有免疫力，他堅持觀察并記錄下各種自然現象，用儀器測定經緯度。他還收集了數以千計的植物和巖石標本，并把它們全部運往古巴。
1801年，洪堡和邦普朗又開始了對哥倫比亞、厄瓜多爾和秘魯的安第斯山脈的探險。洪堡攀登和考察了厄瓜多爾境內的許多火山，為了收集從地球內部釋放出來的氣體，他一再走下活火山口中的深處。在仔細觀察了安第斯山的巖石以后，他認為他的老師維爾納關于巖石皆由水成的說法是錯誤的，并斷言花崗巖、片麻巖和其他結晶巖都是火成巖。他和邦普朗還攀登了欽博拉索山（當時人們認為它是世界最高峰），爬到海拔.. 5878米處，這是當時人類所到過的最高點，這一記錄一直維持了.. 29年之久。在高山峻嶺之中，洪堡忙著用空盒氣壓表測定高度，用溫度表測定氣溫，用磁力儀測定地球磁場，觀察熱帶山區(qū)的氣溫、氣壓、植物和農業(yè)隨高度不同而明顯變化的有趣現象，他還記載了因缺氧而導致的高山疾病的征象。
兩人后來到達秘魯。洪堡在沿海還測量了海水的溫度，他發(fā)現這里有一股從海底向上翻騰的強大的冷水流，即秘魯寒流，后來人們也把它稱為洪堡寒流。然后洪堡和邦普朗渡海到墨西哥，又到古巴。他們把積累下來的大量考察記錄、圖表和日記，以及約.. 6萬件無價之寶的植物與巖石標本，集裝成箱全部運往歐洲。1804年洪堡兩人又到美國去旅行。最后他們從費城乘船離開新大陸，于該年 6月 30日返回歐洲。
他們這次在中、南美洲的旅行考察，其總行程達.. 6.5萬千米，相當于繞行地球一圈半，它成了洪堡開創(chuàng)一生偉大事業(yè)的轉折點。返歸歐洲后不久，洪堡和邦普朗便留居在巴黎，埋頭分析整理帶回來的.. 35箱科學資料，先后達20年之久，最后寫成.. 30卷本的《新大陸熱帶地區(qū)旅行記》。對一個剛剛從地理大發(fā)現所帶來的震驚中恢復平靜的世界來說，洪堡的著作就像吹來了一縷清風，它不僅充滿了異鄉(xiāng)奇域的旅游趣聞，還提供了詳細的科學調查的報導。它的影響是如此之大，以至于進化論的創(chuàng)始者達爾文說他當年曾反復閱讀了洪堡的科學旅行記錄，正是它們改變了他一生的整個過程。
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